Мікроскопічні методи дослідження в мікробіології

Мікроскопічні методи дослідження являють собою способи вивчення різноманітних об`єктів з використанням спеціального обладнання. Воно дозволяє розглядати будову речовин і організмів, величина яких знаходиться за межами роздільної здатності людського погляду. У статті проведемо короткий аналіз мікроскопічних методів дослідження.

Загальні відомості

Сучасні методи мікроскопічного дослідження використовують у своїй практиці різні фахівці. Серед них вірусологи, цитологи, гематологи, морфологи та інші. Основні методи мікроскопічного дослідження відомі досить давно. В першу чергу це світловий спосіб розгляду об`єктів. Протягом останніх років активно вводяться в практику і інші технології. Так, популярність придбали фазово-контрастний, люмінесцентний, інтерференційний, поляризаційний, інфрачервоний, ультрафіолетовий, стереоскопічний метод дослідження. Всі вони базуються на різноманітних властивостях світла. Крім цього, широко використовуються електронно-мікроскопічні методи дослідження. Ці способи дозволяють відобразити об`єкти за допомогою направленого потоку заряджених частинок. Варто зазначити, що такі прийоми вивчення застосовуються не тільки в біології і медицині. досить популярний мікроскопічний метод дослідження металів і сплавів в промисловості. Таке вивчення дозволяє оцінювати поведінку сполук, виробляти технології для мінімізації ймовірності руйнування і посилення міцності.

Відео: Мікробіологія. Приготування фіксованих препаратів (Е. Звонарьова)

Світлові способи: характеристика

такі мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів та інших об`єктів базуються на різній роздільної здатності обладнання. Важливими чинниками при цьому є спрямованість променя, особливості самого об`єкта. Останній, зокрема, може бути прозорим або непрозорим. У відповідності з властивостями об`єкта, змінюються фізичні властивості світлового потоку - яскравість і колір, обумовлені амплітудою і довжиною хвилі, площину, фаза і спрямованість поширення хвилі. На використанні цих характеристик і будуються різні мікроскопічні методи дослідження.

Відео: Мікроскопічне дослідження

специфіка

Для вивчення світловими способами об`єкти, як правило, фарбують. Це дозволяє виявити і описати ті чи інші їх властивості. При цьому необхідно, щоб тканини були фіксованими, оскільки забарвлення виявить певні структури виключно в убитих клітинах. В живих елементах барвник відокремлюється у вигляді вакуолі в цитоплазмі. Вона не фарбує структури. Але за допомогою світлового мікроскопа можна досліджувати і живі об`єкти. Для цього використовується вітальний спосіб вивчення. У таких випадках застосовується темнопольний конденсор. Він вбудовується в світловий мікроскоп.

Вивчення нефарбованих об`єктів

Воно здійснюється за допомогою фазово-контрастної мікроскопії. Цей спосіб базується на дифракції променя відповідно до особливостей об`єкта. У процесі впливу відзначається зміна фази і довжини хвилі. В об`єктиві мікроскопа присутній напівпрозора пластинка. Живі або фіксовані, але не пофарбовані об`єкти через свою прозорості майже не змінюють колір і амплітуду променя, що проходить крізь них, провокуючи тільки зрушення хвильової фази. Але при цьому, пройшовши через об`єкт, світловий потік відхиляється від пластинки. В результаті між променями, пропущеними крізь об`єкт, і входять в світловий фон, з`являється різниця хвильової довжини. При певному її значенні виникає візуальний ефект - темний об`єкт буде чітко видно на світлому тлі або навпаки (відповідно до особливостей фазової пластинки). Для його отримання різниця повинна складати не менше 1/4 довжини хвилі.

аноптрального спосіб

Він є різновидом фазово-контрастного методу. Аноптрального спосіб передбачає використання об`єктива зі спеціальними пластинками, які змінюють тільки колір і яскравість фонового світла. Це істотно розширює можливості вивчення нефарбованих живих об`єктів. Застосовується фазово-контрастний мікроскопічний метод дослідження в мікробіології, паразитології при вивченні рослинних і тваринних клітин, найпростіших організмів. У гематології цей спосіб використовується для розрахунку і визначення диференціювання елементів крові і кісткового мозку.

інтерференційні прийоми

ці мікроскопічні методи дослідження вирішують в цілому ті ж завдання, що і фазово-контрастні. Однак в останньому випадку фахівці можуть спостерігати тільки контури об`єктів. інтерференційні мікроскопічні методи дослідження дозволяють вивчати їх частини, виконувати кількісну оцінку елементів. Це можливо завдяки роздвоєння світлового променя. Один потік проходить крізь частку об`єкта, а інший - мимо. В окулярі мікроскопа вони сходяться і интерферируют. Виникає різниця фаз може визначатися по масі різних клітинних структур. При послідовному її вимірі з заданими показниками заломлення можна встановити товщину нефіксованих тканин і живих об`єктів, вміст білків в них, концентрацію сухої речовини і води та ін. Відповідно до отриманих даних фахівці отримують можливість побічно оцінювати проникність мембран, активність ферментів, клітинний метаболізм.

Відео: Мікробіологічний аналіз харкотиння для діагностики туберкульозу

поляризація

Вона здійснюється за допомогою призм Ніколя або плівчастих поляроидов. Їх поміщають між препаратом і джерелом світла. поляризаційний мікроскопічний метод дослідження в мікробіології дозволяє вивчати об`єкти з неоднорідними властивостями. В ізотропних структурах швидкість поширення світла не залежить від обраної площині. При цьому в анізотропних системах швидкість змінюється відповідно до спрямованістю світла по поперечної або поздовжньої осі об`єкта. У разі якщо величина заломлення уздовж структури буде більше, ніж уздовж поперечної, створюється подвійне позитивне лучепреломление. Це властиво багатьом біологічним об`єктам, у яких виявляється сувора молекулярна орієнтація. Вони всі є анізотропними. До цієї категорії, зокрема, відносяться міофібрили, нейрофібрили, вії в миготливого епітелію, колагенові волокна і інші.

значення поляризації

Порівняння характеру променевого заломлення та показника анізотропії об`єкту дає можливість оцінювати молекулярну організацію структури. Поляризаційний метод виступає як один з гістологічних методів аналізу, використовується в цитології та ін. В світлі можна вивчати не тільки пофарбовані об`єкти. Поляризаційний метод дає можливість досліджувати нефарбовані і нефіксовані - нативні - препарати тканинних зрізів.

люмінесцентні прийоми

Вони базуються на властивостях деяких об`єктів давати світіння в синьо-фіолетовому ділянці спектра або в УФ-променях. Багато речовин, наприклад білки, деякі вітаміни, коферменти, лікарські засоби, наділені первинної (власної) люмінесценції. Інші об`єкти починають світитися при додаванні флюорохромів - спеціальних барвників. Ці добавки вибірково або дифузно поширюються на окремі клітинні структури або хімічні сполуки. Це властивість лягло в основу використання люмінесцентної мікроскопії при гістохімічних і цитологічних дослідженнях.

області використання

Застосовуючи імуно-флуоресценції, фахівці виявляють вірусні антигени і встановлюють їх концентрацію, ідентифікують віруси, анти тіла і антигени, гормони, різноманітні продукти метаболізму і так далі. У зв`язку з цим при діагностиці герпесу, епідемічного паротиту, вірусного гепатиту, грипу та інших інфекцій використовуються люмінесцентні методи дослідження матеріалів. мікроскопічний імуно-флуоресцентний спосіб дозволяє розпізнавати пухлини злоякісного характеру, визначати ішемічні ділянки в серці на ранніх етапах інфаркту та ін.

Використання ультрафіолету

Воно грунтується на здатності ряду речовин, включених в живі клітини, мікроорганізми або фіксовані, але нефарбовані, прозорі при видимому світлі тканини поглинати УФ-промені певної довжини хвиль. Це характерно, зокрема, для високомолекулярних сполук. До них відносять білки, ароматичні кислоти (метілаланін, триптофан, тирозин та ін.), Нуклеїнові кислоти, пірамідіновие і пуринові основи і так далі. Ультрафіолетова мікроскопія дозволяє уточнити локалізацію і кількість цих сполук. При вивченні живих об`єктів фахівці можуть спостерігати зміни процесів їх життєдіяльності.

додатково

Інфрачервона мікроскопія використовується при дослідженні непрозорих для світла і УФ-променів об`єктів за допомогою поглинання їх структурами потоку, довжина хвилі якого 750-1200 нм. Щоб застосувати цей спосіб немає необхідності попередньо піддавати препарати хімічній обробці. Як правило, інфрачервоний метод використовується в антропології, зоології та інших біологічних галузях. Що стосується медицини, то цей спосіб застосовують переважно в офтальмології та нейроморфологии. Вивчення об`ємних об`єктів здійснюється за допомогою стереоскопічної мікроскопії. Конструкція обладнання дозволяє виконувати спостереження лівим і правим оком під різним кутом. Непрозорі об`єкти досліджуються при порівняно невеликому збільшенні (не більше 120 разів). Стереоскопічні способи використовуються в мікрохірургії, патоморфології, в судовій медицині.

Відео: Rob Knight: How our microbes make us who we are

Електронна мікроскопія

Вона використовується для вивчення структури клітин і тканин на макромолекулярному і субклітинному рівнях. Електронна мікроскопія дозволила зробити якісний стрибок в сфері досліджень. Цей спосіб широко застосовується в біохімії, онкології, вірусології, морфології, імунології, генетики та інших галузях. Значне посилення роздільної здатності устаткування забезпечується потоком електронів, які проходять в вакуумі крізь електромагнітні поля. Останні, в свою чергу, створюються спеціальними лінзами. Електрони мають здатність проходити крізь структури об`єкта або відбиватися від них з відхиленнями під різними кутами. В результаті створюється відображення на люмінесцентному екрані приладу. При просвічує мікроскопії виходить площинне зображення, при скануючої, відповідно, об`ємне.

Необхідні умови

Варто відзначити, що перед тим, як пройти електронне мікроскопічне дослідження, об`єкт піддається спеціальній підготовці. Зокрема, використовується фізична або хімічна фіксація тканин і організмів. Секційний і біопсійний матеріал, крім цього, зневоднюють, впроваджують в епоксидні смоли, розрізають алмазними або скляними ножами на ультратонкі зрізи. Потім їх контрастують і вивчають. У сканирующем мікроскопі досліджуються поверхні об`єктів. Для цього на них напилюють спеціальні речовини у вакуумній камері.