Флуоресцентна мікроскопія: принципи методу

Поглинання і подальше переизлучение світла неорганічними і органічними середовищами є результатом фосфоресценції або флуоресценції. Різниця між феноменами полягає в тривалості інтервалу між світловим поглинанням і випусканням потоку. При флуоресценції ці процеси відбуваються практично одночасно, а при фосфоресценції - з деяким запізненням.

Історична довідка

У 1852 р британський вчений Стокс вперше описав флуоресценцію. Він ввів новий термін в результаті виконаних експериментів з плавиковий шпат, який випускав червоне світло під впливом ультрафіолету. Стокс зазначив цікаве явище. Він виявив, що довжина хвилі при флуоресцентного випромінювання завжди більше, ніж у потоку світла збудження.

Відео: Молекулярка до Всеросс. конфокальна мікроскопія

Для підтвердження гіпотези в 19-м столітті було проведено безліч експериментів. Вони показали, що різноманітні зразки флуоресцируют під дією ультрафіолету. Серед матеріалів, в числі іншого, були кристали, смоли, мінерали, хлорофіл, лікарську сировину, неорганічні сполуки, вітаміни, масла. Безпосереднє ж застосування барвників для проведення біологічних аналізів почалося тільки в 1930 р

Флуоресцентна мікроскопія: опис

Деякі з матеріалів, використаних в дослідженнях першої половини 20-го століття, мали високу специфічність. Завдяки показниками, які не могли бути досягнуті контрастними способами, метод флуоресцентної мікроскопії став найважливішим інструментом і в біомедичних, і в біологічних дослідженнях. Важливе значення отримані результати мали і для матеріалознавства.

Які переваги має метод флуоресцентної мікроскопії? За допомогою нових матеріалів стало можливим виділення високоспецифічних клітин і субмикроскопических компонентів. Флуоресцентний мікроскоп дозволяє виявити окремі молекули. Різноманітні барвники дозволяють ідентифікувати кілька елементів одночасно. Незважаючи на обмеженість просторового дозволу обладнання дифракційною межею, який, в свою чергу, залежить від специфічних властивостей зразка, виявлення молекул нижче цього рівня також цілком можливо. Різні зразки після опромінення виявляють автофлуоресценцію. Це явище досить широко застосовується в петрології, ботаніки, напівпровідникової промисловості.

Особливості

Вивчення тваринних тканин або патогенних мікроорганізмів часто ускладнюється або занадто слабкою, або дуже сильною неспецифічної автофлуоресценціей. Однак значення в дослідженнях набуває внесення в матеріал компонентів, порушуваних у конкретній довжині хвилі і випускають світловий потік необхідної інтенсивності. Флуорохроми виступають в якості барвників, здатних самостійно прикріплятися до структур (невидимим або видимим). При цьому вони відрізняються високою вибірковістю щодо мішеней і квантовим виходом.

флуоресцентна мікроскопія стала широко застосовуватися з появою природних і синтетичних барвників. Вони володіли певними профілями інтенсивності випущення і збудження і були націлені на конкретні біологічні мішені.

Виявлення окремих молекул

Часто в ідеальних умовах можна зареєструвати світіння окремого елемента. Для цього, крім іншого, потрібно забезпечити досить низький шум детектора і оптичний фон. Молекула флуоресцеїну до руйнування внаслідок фотознебарвлення може випускати до 300 тис. Фотонів. При 20% збирання та ефективності процесу їх можна зареєструвати в кількості близько 60 тис.

Відео: Цитологія. Загальні принципи будови клітин. Клітинна теорія. Про- і еукаріоти

флуоресцентна мікроскопія, заснована на лавинних фотодиодах або електронному множенні, дозволяла дослідникам спостерігати поведінку окремих молекул протягом секунд, а в ряді випадків і хвилин.

складнощі

Ключовою проблемою виступає придушення шуму від оптичного фону. У зв`язку з тим, що багато хто з матеріалів, використовуваних в конструкції фільтрів і лінз, проявляють деяку автофлуоресценцію, зусилля вчених на початкових етапах були орієнтовані на випуск компонентів, що володіють малою флуоресценцией. Проте подальші експерименти привели до нових висновків. Зокрема, було встановлено, що флуоресцентна мікроскопія, заснована на повному внутрішньому відбитті, дозволяє досягти низького фону і високоінтенсивного збудливого світлового потоку.

механізм

Принципи флуоресцентної мікроскопії, заснованої на повному внутрішньому відбитті, полягають у використанні бистрозатухающей або поширює хвилі. Вона виникає на межі середовищ з різними показниками заломлення. В даному випадку світловий пучок проходить крізь призму. Вона має високий параметром заломлення.

Призма прилягає до водного розчину або склу з низьким параметром. Якщо потік світла направляється на неї під кутом, який більше критичного, пучок повністю відбивається від межі розділу. Це явище, в свою чергу, викликає не поширює хвилю. Іншими словами, генерується електромагнітне поле, проникаюче в середу з меншим параметром заломлення на відстань менше 200 нанометрів.

У поширює хвилі інтенсивність світла буде цілком достатньою для збудження флуорофорів. Однак внаслідок її виключно незначною глибини його обсяг буде дуже малим. В результаті виникає низькорівневий фон.

модифікація

Флуоресцентна мікроскопія, заснована на повному внутрішньому відбитті, може реалізовуватися за допомогою епі-освітлення. Для цього необхідні об`єктиви з підвищеною числовою апертурою (як мінімум 1.4, проте бажано, щоб вона досягала 1.45-1.6), а також частково освітлене поле апарату. Останнє досягається за допомогою плями невеликого розміру. Для більшої рівномірності використовується тонке кільце, за допомогою якого блокується частина потоку. Для отримання критичного кута, після якого виникає повне відображення, потрібен високий рівень заломлення імерсійної середовища в лінзах і покривного скельця мікроскопа.