Іммобілізовані ферменти та їх застосування

Вперше поняття про іммобілізованих ферментах виникло в другій половині 20-го століття. Тим часом, ще в 1916 році було встановлено, що сорбированная на вугіллі сахароза зберігала каталітичну активність. У 1953 р Д. Шлейт і Н. Грубхофер здійснили перші зв`язування пепсину, амілази, карбоксипептидази і РНКази з нерозчинним носієм. Поняття іммобілізованих ферментів було узаконено в 1971 р Це сталося на першій конференції з питань інженерної ензимології. У теперішній же час поняття про іммобілізованих ферментах розглядається в більш широкому сенсі, ніж це було в кінці 20 століття. Розглянемо цю категорію докладніше.

Відео: 9.Ферменти.wmv

Загальні відомості

Іммобілізованние ферменти - З`єднання, які штучно пов`язуються з нерозчинним носієм. При цьому вони зберігають свої каталітичні властивості. В даний час цей процес розглядається в двох аспектах - в рамках часткової і повної обмеженості свободи переміщення білкових молекул.

переваги

Вчені встановили певні переваги іммобілізованих ферментів. Виступаючи в якості гетерогенних каталізаторів, вони можуть з легкістю відділятися від реакційного середовища. В рамках досліджень встановлено, що застосування іммобілізованих ферментів може бути багаторазовим. В процесі зв`язування сполуки змінюють свої властивості. Вони набувають субстратне специфічність, стійкість. При цьому їх активність починає залежати від умов середовища. іммобілізовані ферменти відрізняються довговічністю і високим ступенем стабільності. Вона більше, ніж, наприклад, у вільних ензимів в тисячі, десятки тисяч разів. Все це забезпечує високу ефективність, конкурентоспроможність і економічність технологій, в яких присутні іммобілізовані ферменти.

носії

Дж. Порато визначив ключові властивості ідеальних матеріалів, які повинні використовуватися при іммобілізації. Носії повинні володіти:

1. Розчиняється.
2. Високою біологічною і хімічною стійкістю.
3. Здатністю до швидкої активації. Носії повинні легко переходити в реакційно-здатний вид.
4. Значною гидрофильностью.
5. Необхідною проникністю. Її показник повинен бути однаково прийнятний і для ферментів, і для коферментів, продуктів реакції і субстратів.

В даний час не існує матеріалу, який би повністю відповідав цим вимогам. Проте на практиці застосовуються носії, які придатні до іммобілізації певної категорії ферментів в конкретних умовах.

Класифікація

Залежно від своєї природи матеріали, при зв`язку з якими з`єднання перетворюються в іммобілізовані ферменти, поділяються на неорганічні і органічні. Зв`язування багатьох з`єднань здійснюється з полімерними носіями. Ці органічні матеріали поділяють на 2 класи: синтетичні і природні. У кожному з них, в свою чергу, виділяють групи в залежності від будови. Неорганічні носії представлені переважно матеріалами зі скла, кераміки, глини, силікагелю, графітової сажі. При роботі з матеріалами популярні методи сухого хімії. Іммобілізовані ферменти одержують шляхом покриття носіїв плівкою оксидів титану, алюмінію, цирконію, гафнію або обробки органічними полімерами. Важливою перевагою матеріалів є легкість регенерації.

білкові носії

Найбільшою популярністю користуються ліпідні, полісахаридні і білкові матеріали. Серед останніх варто виділити структурні полімери. До них в першу чергу відносять колаген, фібрин, кератин, а також желатин. Такі білки досить широко поширені в природному середовищі. Вони доступні і економічні. Крім цього, вони мають більшу кількість функціональних груп для зв`язування. Білки відрізняються здатністю до біодеградації. Це дозволяє розширити застосування іммобілізованих ферментів в медицині. Тим часом, є у білків і негативні властивості. Недоліки використання іммобілізованих ферментів на протеїнових носіях полягають у високій імуногенності останніх, а також можливість впроваджувати в реакції тільки певні їх групи.

Полісахариди, аміносахаридом

З цих матеріалів найчастіше застосовуються хітин, декстран, целюлоза, агароза і їх похідні. Щоб полісахариди були більш стійкі до реакцій, їх лінійні ланцюги зшивають поперечно епіхлоргідрином. У сітчасті структури досить вільно вводяться різні іоногенні угруповання. Хітин в великих кількостях накопичується у вигляді відходів при промисловій переробці креветок і крабів. Ця речовина відрізняється хімічною стійкістю і володіє добре вираженою пористою структурою.

синтетичні полімери

Ця група матеріалів відрізняється великою різноманітністю і доступністю. У неї включені полімери на основі акрилової кислоти, стиролу, полівінілового спирту, поліуретанові і поліамідні полімери. Більшість з них відрізняються механічною міцністю. У процесі перетворення вони забезпечують можливість варіювання розміру пір в досить широких межах, введення різноманітних функціональних груп.

Відео: Ферменти

способи зв`язування

В даний час існує два принципово відмінних один від одного варіанта іммобілізації. Першим є отримання сполук без ковалентних зв`язків з носієм. Цей спосіб є фізичним. Інший варіант передбачає виникнення ковалентного зв`язку з матеріалом. Це хімічний метод.

адсорбція

За допомогою неї іммобілізовані ферменти отримують шляхом утримування препарату на поверхні носія завдяки дисперсійним, гідрофобним, електростатичним взаємодіям і водневим зв`язкам. Адсорбція стала першим способом обмеження рухливості елементів. Однак і в даний час цей варіант не втратив своєї актуальності. Більш того, адсорбція вважається найбільш поширеним способом іммобілізації в промисловості.

особливості способу

У наукових виданнях описано понад 70 ферментів, отриманих адсорбційним методом. В якості носіїв виступали, переважно, пористе скло, різноманітні глини, полісахариди, оксиди алюмінію, синтетичні полімери, титан і інші метали. При цьому останні використовуються найчастіше. Результативність адсорбції препарату на носії визначається по пористості матеріалу і питомої поверхні.

Механізм дії

Адсорбція ферментів на нерозчинних матеріалах відрізняється простотою. Вона досягається при контакті водного розчину препарату з носієм. Він може проходити статичним або динамічним способом. Розчин ферменту перемішується зі свіжим осадом, наприклад, гідроксиду титану. Потім в м`яких умовах з`єднання висушується. Активність ферменту при такій іммобілізації зберігається майже на всі 100%. При цьому питома концентрація досягає 64 мг на грам носія.

негативні моменти

До недоліків адсорбції відносять невисоку міцність при зв`язуванні ферменту і носія. У процесі змін умов реакції можуть відзначатися втрата елементів, забруднення продуктів, десорбція білка. Для підвищення міцності зв`язування носії попередньо модифікують. Зокрема, матеріали обробляють іонами металів, полімерами, гідрофобними сполуками та іншими поліфункціональними агентами. У ряді випадків модифікації піддають сам препарат. Але досить часто це призводить до зменшення його активності.

Включення в гель

Цей варіант досить поширений завдяки своїй унікальності і простоті. Цей спосіб підходить не тільки для індивідуальних елементів, але і для мультиензимних комплексів. Включення в гель може виконуватися двома методами. У першому випадку препарат з`єднують з водним розчином мономеру, після чого виконують полімеризацію. В результаті виникає просторова структура гелю, що містить в осередках молекули ферменту. У другому випадку препарат вноситься в розчин готового полімеру. Потім його переводять в стан гелю.

Впровадження в напівпрозорі структури

Суть даного методу іммобілізації полягає в відділенні водного ферментного розчину від субстрату. Для цього використовується напівпроникна мембрана. Вона пропускає низькомолекулярні елементи кофакторов і субстратів і затримує великі молекули ферментів.

Мікрокапсулювання

Існує кілька варіантів впровадження в напівпрозорі структури. Найбільший інтерес з них представляють микрокапсулирование і включення білків в ліпосоми. Перший варіант був запропонований в 1964 р Т. Чангом. Він полягає в тому, що ферментний розчин впроваджується в замкнуту капсулу, стінки якої виконані з напівпроникного полімеру. Виникнення мембрани на поверхні обумовлюється реакцією межфазной поліконденсації сполук. Одне з них розчинено в органічній, а інше - у водній фазі. Як приклад можна назвати освіту мікрокапсули, одержуваної поликонденсацией галогенангідриди себациновой к-ти (органічна фаза) і гексаметилендиамина-1,6 (відповідно, водна фаза). Товщина мембрани обчислюється в сотих частках мікрометра. При цьому величина капсул - сотні або десятки мікрометрів.

Включення в ліпосоми

Цей метод іммобілізації близький до Мікрокапсулювання. Ліпосоми представлені в ламеллярной або сферичних системах ліпідних бішару. Цей спосіб вперше був застосований в 1970 р Для виділення ліпосом з ліпідного розчину проводять випарювання органічного розчинника. Частина, що залишилася тонка плівка диспергується у водному розчині, в якому присутній фермент. В ході цього процесу відбувається самосборка ліпідних біслойних структур. Досить популярні такі іммобілізовані ферменти в медицині. Це обумовлюється тим, що велика частина молекул локалізується в ліпідному матриксі біологічних мембран. Включені в ліпосоми іммобілізовані ферменти в медицині є найважливішим дослідницьким матеріалом, що дозволяє вивчати і описувати закономірності процесів життєдіяльності.

Утворення нових зв`язків

Іммобілізація шляхом формування нових ковалентних ланцюгів між ферментами і носіями вважається найбільш масовим методом отримання биокатализаторов промислового призначення. На відміну від фізичних способів цей варіант забезпечує необоротну і міцний зв`язок молекули і матеріалу. Її утворення часто супроводжується стабілізацією препарату. Разом з тим розташування ферменту на відстані 1-й ковалентного зв`язку щодо носія створює певні складнощі у виконанні каталітичного процесу. Молекулу відокремлюють від матеріалу за допомогою вставки. Як неї часто виступають полі- і біфункціональні агенти. Ними, зокрема, є гідразин, бромціан, глутаровий діальгедрід, сульфурілхлорід тощо. Наприклад, для виведення галактозілтрансферази між носієм і ферментом вставляють наступну послідовність СН₂-NH- (СН₂)₅-СО-. У такій ситуації в структурі присутній вставка, молекула і носій. Всі вони з`єднуються ковалентними зв`язками. Принципове значення має необхідність впровадження в реакції функціональних груп, які не істотних для каталітичної функції елемента. Так, як правило, глікопротеїни приєднуються до носії не через білкову, а через вуглеводну частину. В результаті отримують більш стійкі і активні іммобілізовані ферменти.

клітини

Описані вище способи вважаються універсальними для всіх типів биокатализаторов. До них, в тому числі, відносять клітини, субклітинні структури, іммобілізація яких набуває останнім часом широкого поширення. Це обумовлюється наступним. При іммобілізації клітин відпадає необхідність виділяти і очищати ферментні препарати, впроваджувати в реакції кофактор. В результаті з`являється можливість отримувати системи, які здійснюють багатостадійні безперервно протікають процеси.

Застосування іммобілізованих ферментів

У ветеринарії, промисловості, інших господарських галузях досить популярні препарати, отримані зазначеними вище способами. Вироблені на практиці підходи забезпечують рішення проблем по здійсненню спрямованої доставки ліків в організмі. Іммобілізовані ферменти дозволили отримати медикаменти пролонгованої дії з мінімальною алергенність і токсичністю. В даний час вчені вирішують проблеми, пов`язані з Біоконверсія маси і енергії, використовуючи мікробіологічні підходи. Тим часом, істотний внесок в роботу вносить і технологія іммобілізованих ферментів. Перспективи розвитку представляються вченими досить широкими. Так, в майбутньому одна з ключових ролей в процесі контролю над станом навколишнього середовища повинна належати новим видам аналізу. Зокрема, мова про біолюмінесцентному і иммуноферментном методах. Особливе значення передові підходи мають в переробці лігноцелюлозної сировини. Можна використовувати іммобілізовані ферменти в якості підсилювачів слабких сигналів. Активний центр може знаходитися під впливом носія, що знаходиться під ультразвуком, механічними навантаженнями або схильного фітохімічним перетворенням.