Молекулярно-біологічні методи дослідження та їх использование

Молекулярно-біологічні методи дослідження відіграють велику роль в сучасній медицині, кріміналістіці и биологии. Завдяк досягнені в області Вивчення ДНК и РНК, людина здатно вівчіті геном організму, візначіті Збудник захворювання, розпізнати потрібну нуклеїнових кислот в суміші кислот и т.д.

Відео: Майстер-клас "Методи молекулярної біології. Полімеразна ланцюгова Реакція (ПЛР)"

Молекулярно-біологічні методи дослідження. Що це таке?

Ще в 70-80-х роках ученим Вперше удалось Розшифрувати геном людини. Ця Подія дала Поштовх розвитку генної інженерії та молекулярної біології. Вивчення властівостей ДНК и РНК прізвело до того, что теперь можна використовуват ЦІ нуклеїнові кислоти з метою діагностики захворювання, Вивчення генів.

Відео: 7 Засідання (16.04.2015) Класичні и молекулярно-генетичні методи дослідження мікрофлорі.

Отримання ДНК и РНК

Молекулярно-біологічні методи діагностики вімагають наявності віхідного матеріалу: Частіше це нуклеїнові кислоти. Існує кілька способів віділення ціх Речовини з клітін живих організмів. КОЖЕН з них має свои Преимущества и Недоліки, и це треба враховуваті при віборі методу віділення нуклеїнових кислот в чистому виде.

1. Отримання ДНК по мармуру. Метод Полягає в обробці суміші Речовини спиртом, в результате чего чистий ДНК віпадає в облог. Мінусом цього способу є использование агресивних Речовини: фенолу и хлороформу.

2. Віділення ДНК з Буму. Основна Речовини, что вікорістовується тут, - це гуанидин тіоціонат (GuSCN). Воно спріяє осадженим дезоксірібонуклеїнової кислоти на спеціалізованіх субстратах, з якіх в подалі можна ее зібраті с помощью спеціального буфера. Однако GuSCN - це інгібітор ВТЦ, и даже невелика его частина, что попала в обкладенню ДНК, может вплінуті на Хід полімеразної ланцюгової Реакції, яка відіграє важліву роль при роботі з нуклеїновімі кислотами.

3. осадженим домішок. Метод відрізняється від попередніх тим, что осідають НЕ Власний молекули дехоксірібонуклеіновой кислоти, а домішки. Щоб це здійсніті, Використовують ионообменники. Недолік у тому, что НЕ всі Речовини могут облоги.

4. Масовий скринінг. Вікорістовується цею способ в тих випадка, коли не потрібні Точні Відомості про склад молекули ДНК, а необходимо отріматі якісь статистичні дані. Пояснюється це тим, что структура нуклеїнової кислоти может пошкодітіся при обробці детергентами, зокрема, луками.

Класифікація методів дослідження

Всі молекулярно-біологічні методи дослідження діляться на три Великі групи:

1. ампліфікаціонніх (з використаних безлічі ферментів). Так само як ПЛР - полімеразна ланцюгова Реакція, яка відіграє велику роль у багатьох з методів діагностики.

2. неампліфікаціонніе. Ця група методів пов`язана безпосередно з роботом сумішей нуклеїнових кислот. Прикладами є 3 види блоттинга, in situ гібрідізація и т.д.

3. Методи, засновані на розпізнаванні сигналу від молекули зонда, Який зв`язується з Певної ДНК або РНК зонда. Приклад - система гібрідізації в розчіні Hybride Capture System (hc2).

Ферменти, Які могут використовуват в молекулярно-біологічних методів дослідження

Много методи молекулярної діагностики ма ють на увазі использование великого діапазону ферментів. Нижчих представлені застосовуються найчастіше:

1. рестріктаза - «ріже» молекулу ДНК на необхідні части.

2. ДНК-полімераза - сінтезує двухцепочечную молекулу дезоксірібонуклеїнової кислоти.

3. Зворотна транскриптаза (ревертаза) - вікорістовується для синтезу ДНК на матриці РНК.

4. ДНК-лігаза - відповідає за освіту фосфодіефірніх зв`язків между нуклеотидами.

5. екзонуклеаза - відаляє нуклеотиди з кінцевіх ділянок молекули дезоксірібонуклеїнової кислоти.

ПЛР - основний способ ампліфікації ДНК

Полімеразна ланцюгова Реакція (ПЛР) активно вікорістовується в сучасній молекулярній біології. Це метод, при якому з однієї молекули ДНК можна отріматі Величезне Кількість Копій (ампліфікуваті молекули).

Основні Функції ПЛР:

- діагностика захворювань;

- клонування ділянок ДНК, генів.

Для проведення полімеразної ланцюгової Реакції необхідні следующие елементи: віхідна молекула ДНК, термостабильная ДНК-полімераза (Taq або Pfu), дезоксірібонуклеотідов-фосфат (джерела азотистих основ), праймери (2 праймера на 1 молекулу ДНК) и сама буферна система, в Якій можливе проведення всех реакцій.

ПЛР складається з трьох етапів: денатурація, отжиг праймерів и елонгація.

1. Денатурація. При температурі 94-95 градусів за Цельсієм просходит розрив водневіх зв`язків между двома ланцюг ДНК, и в результате ми отрімуємо две одноцепочечніє молекули.

2. Відпал праймерів. При температурі 50-60 градусів за Цельсієм відбувається Приєднання праймерів на кінцях одноланцюговіх молекул нуклеїнової кислоти за типом компліментарності.

3. Елонгація. При температурі 72 градусів відбувається синтез дочірніх дволанцюжковіх молекул дезоксірібонуклеїнової кислоти.

секвенування ДНК

Молекулярно-біологічні методи дослідження часто вімагають знання послідовності нуклеотидів в молекулі дезоксірібонуклеїнової кислоти. для визначення генетичного коду проводитися секвенування. Молекулярна діагностика майбутнього буде засновано на знаннях, отриманий при візначенні послідовності людини.

Віділяють следующие види секвенування: